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蛋白质的结构提供了大量理解蛋白质功能的信息，也有利于阐明人类疾病的分子机制。结构测定和分析工具的快速发展使研究人员能进一步处理复杂的蛋白质，如膜蛋白、抗体和多蛋白复合体，为现代临床药物设计提供见解。本文将介绍蛋白质结构的四个层次，以及在每个层次上进行结构研究所使用的不同技术。
蛋白质结构的四个层次
蛋白质一级结构"
蛋白质是由不同顺序和不同长度的肽键连接在一起的氨基酸组成的，从30个氨基酸到100,000多个氨基酸不等。因此，蛋白质的结构从其氨基酸序列开始，这被认为是其初级结构。每种类型的蛋白质都拥有独特的初级结构，它驱动着线性氨基酸链的结合和折叠，并zuì终决定了蛋白质的独特三维形状。
蛋白质的二级结构
蛋白质的二级结构是指多肽链上由主链原子间的分子内相互作用形成的局部折叠模式。二级结构的形成主要是由多肽链上氨基和羧基之间的氢键作用驱动的。
zuì常见的二级结构类型是α螺旋和β折叠。当多肽链自身旋转时，就形成了α螺旋，一个类似于螺旋楼梯的结构基序。当多肽链的多个片段并排在一起时，片段之间会形成氢键将其连接起来，从而形成β折叠。大多数蛋白质含有α螺旋和β折叠。例如，α螺旋在膜蛋白和毛细胞中（即α-角蛋白）尤其丰富，而β折叠在动物和细菌的淀粉样纤维中广泛存在。
蛋白质的三级结构
单个多肽链（蛋白质分子）的整体三维构象称为三级结构，通常包括不同的二级结构，例如α螺旋、β折叠、无规卷曲和环。氨基酸侧链（R基团）之间的键—包括疏水相互作用、氢键和离子键—有助于形成三级结构。
此外，还有一种共价键也可以构成三级结构：二硫键。二硫键是在半胱氨酸残基的含硫侧链之间形成的一种翻译后修饰，可使蛋白质上较远距离氨基酸结合在一起。它们大量存在于分泌蛋白和膜蛋白的细胞外结构域中。
蛋白质的四级结构
许多蛋白质由不止一条多肽链组成以发挥其功能。这种蛋白质的完整结构称为四级结构，每条多肽链称为一个亚基。四级结构由与三级结构相同的键稳定，包括不同的非共价键和二硫键。这些键将亚基结合在一起，并自行排列形成更大的蛋白质复合物。
如何研究蛋白质结构？
蛋白质一级结构研究技术
蛋白质的结构分析通常从确定其一级结构开始：氨基酸序列。这可以依赖于两种类型的方法：1) 基于质谱（MS）的蛋白质测序，以及 2) Edman降解。前者特别适用于对大型蛋白质（超过40个氨基酸残基）进行测序。如今，随着基于MS的蛋白质组学的快速发展，从头蛋白测序法得以问世，使得快速准确地确定任何给定蛋白质的序列不再是空想。蛋白质的一级结构也可以通过肽图分析，这是另一种基于MS的方法，非常适合验证序列和识别序列变异，如点突变。
蛋白质二级结构研究技术
研究蛋白质的二级结构zuì常用的方法是圆二色谱（CD）。它根据远紫外光谱区的特征光谱测量蛋白质中的不同二级结构元素，包括α螺旋和β折叠以及无规卷曲。然后可以使用这些光谱来量化蛋白质中每个二级结构元素的分数。另一种生物物理方法，傅里叶变换红外（FTIR）光谱，也可用于通过测量蛋白质样品吸收红外辐射（IR）的波长和强度来分析蛋白质中的二级结构成分。此外，还有多种用于二级结构预测的生物信息学工具，研究人员可借助其解释蛋白质结构组织。
蛋白质三级结构研究技术
蛋白质的三级结构或三维结构主要使用X射线晶体学、核磁共振（NMR）光谱或低温电子显微镜（cryo-EM）来确定。每种方法都有其优点和缺点。 通常，通过这些方法，可以收集不同类型的实验数据（即X射线衍射、化学位移）来测量原子之间的距离，并在原子水平上生成蛋白质结构的三维模型。迄今为止，已经确定了超过 190,000 种不同蛋白质的 3D 结构。除上述方法外，氢-氘交换（HDX）-MS也是一种强大的蛋白结构分析技术，通常与其他结构技术相结合，以获得有关蛋白质构象、动力学和折叠的重要信息，从而获得更全面的结构图像。近年来许多用于预测蛋白质3D结构的计算机工具也迅速涌现，如Alphafold。
蛋白质四级结构研究技术
可以使用与三级结构相同的方法研究蛋白质的四级结构。cryo-EM技术的进步使其在具有复杂四级结构的大型蛋白质复合物的高分辨率可视化方面越来越受欢迎。HDX-MS 还特别适用于研究蛋白质相互作用，例如抗体-抗原结合。
蛋白质结构研究方法总结
用于研究蛋白质各个结构层次的方法表
结构层次
研究方法
初级结构
Edman降解法、从头测序、肽谱图
二级结构
圆二色谱、傅里叶变换红外光谱、计算机预测
三级结构
X射线晶体学、核磁共振、电子显微镜、氢氘质谱、计算机预测
四级结构
X射线晶体学、核磁共振、电子显微镜、氢氘质谱、计算机预测
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