导读
? 蛋白质从头测序是什么？
? 蛋白质从头测序分析流程是什么？
? 蛋白质从头测序数据分析的理论基础是什么？
一、蛋白质从头测序的原理
简单来说蛋白质从头测序就是不依赖于任何现有的DNA或者蛋白质的数据库信息，直接对蛋白质氨基酸序列进行测定。蛋白质从头测序的原理是基于蛋白酶切后的肽段分子在质谱检测中有规律性的断裂，找到特定断裂模式，再根据质谱峰之间质量差即可算出对应的氨基酸信息，以及氨基酸上的翻译后修饰。
蛋白质从头测序的优势特点
蛋白质从头测序法的一大特点就是可以不借助任何蛋白质或者DNA数据库信息，直接对蛋白质的序列进行分析。相比传统的质谱数据库搜索法有着不可比拟的优势，那就是从头测序法可以应用于分析新物种的蛋白质序列，以及基因组未被测序的物种的蛋白质序列。
二、蛋白质从头测序的分析流程
图1. 蛋白质从头测序的分析流程图
蛋白质从头测序的分析流程
1-. 使用蛋白酶对分离纯化后的待测蛋白质样品进行酶切，将蛋白质剪切成一定大小的多肽片段。（可以分别选用多种蛋白酶进行酶切，以确保蛋白质的全序列可以被鉴定分析到）
2. 使用高效液相色谱对肽段酶切产物进行分离纯化，这样有利于接下来更为高效准确的质谱分析。
3. 被分离的肽段再经由质谱分析前首先经过软电离处理使肽段带上一定量的电荷，接着飞行进入质谱仪。首先经过一级质谱对肽段离子进行筛选。
4. 经过一级质谱筛选后的肽段分子，再进入碰撞室，与室内的碰撞气体（常用的碰撞气体通常有He，Ar，Xe，CH4等惰性气体）进行碰撞诱导肽段共价键断裂，产生子离子，再经由二级质谱（MS2）分析肽段序列。
5. 借助特定软件对各个肽段的二级质谱峰进行从头序列分析，再对肽段序列拼接获得蛋白质全长序列。
上面我们讲到了蛋白质从头测序的分析流程，熟悉质谱鉴定的同学能够发现，蛋白质从头测序的实验流程与常见的串联质谱分析大同小异，那么大家看到这可能想要问了，那么蛋白质从头测序法究竟是如何实现直接对蛋白质的序列进行分析的呢？其实，从头测序分析的核心就在于对二级质谱峰的数据分析上面。那么接下来，小编就给大家详细地介绍从头测序数据分析的基础原理。
三、蛋白质从头测序数据分析原理
小编在文章前面介绍蛋白从头测序的原理时，也提到过蛋白质从头测序分析的理论基础是基于肽段在二级质谱诱导碎裂时是有规律地断裂的。根据肽段断裂的位置，可以产生不同种类的离子，在靠近N端的地方断裂产生的离子有a，b，c三种类型的离子，在靠近C端的地方断裂产生的离子有x，y，z三种类型。以N端断裂离子为例，其中a型离子由第一个氨基酸C=O前面的C-C键断裂产生的N端离子，b型离子是由第一个氨基酸和第二个氨基酸之间的C-N键断裂产生N端离子，c型离子是由第二个氨基酸的N-C键断裂形成的（如图2所示）。对于N端端裂的离子来说，断裂的位置不同产生多种不同的a，b，c型离子，为了进一步对在不同的断裂点产生的同一类型的离子进行区分，每个离子下方都标记了罗马数字指代断裂的位置。（如图2，a1，a3指代断裂位置不同的同一类a型离子）
图2. 肽段断裂产生的子离子类型
介绍完肽段碎裂的规律后，我们可以发现每个肽段碎裂产生的离子都有各自的特点，其中b型离子较为特殊，因为b型离子断键的位置位于两个氨基酸残基之间，因此每两个相邻的b离子的质量差等于NH2C2O-R（如图3所示）。不同的氨基酸的R基质量是不同的，因此，如果能够在二级质谱的众多质谱峰中确定b离子的峰图，根据出两个相邻的b型离子的质量差，就可计算出R基的质量大小，然后根据R基即可确定对应的氨基酸。除此之外，如果氨基酸残基上有翻译后修饰，也可以使用b型离子间的质量差来计算翻译后修饰的质量，从而推算可能的翻译后修饰。
图3. b型离子断裂模式
由于经过一次碎裂碰撞，大多数肽段只会有一处断裂，因此，只要在二级谱图中找到b型离子的分布图谱，那么每两个b型离子的质量差就是氨基酸的质量，我们可以使用这一信息找到质量匹配的氨基酸。
但是从二级谱图中众多的离子峰来确定b型离子的质谱峰，涉及到复杂的建模以及概率推算，因此，依靠人工的方法选择b型离子的峰图是不现实的，目前有许多从头测序分析的软件可以帮助我们完成这一步骤，例如， PEAKS和NovoHMM等。不同的软件对b型离子图谱推算原理各有不同，但都是推测的数据需要与实际测得的图谱进行多次比对，才能实现对序列的精准无误的分析。
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